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정체불명의 악당 마스크맨이 미스터리 주식회사가 제거했던 익룡, 흑기사, 타르, 좀비, 1만볼트 몬스터 등을 몬스터 제조기를 이용해 재창조해 쿨스빌을 습격한다. 갑작스런 몬스터들의 등장으로 대외 신용도가 급격히 추락한 미스터리 주식회사는 냉혹한 TV 리포터 헤더 재스퍼-하우(알리시아 실버스톤)와 쿨스빌 시민들의 성화에 떠밀려 사건 수사에 착수하게 된다. 한편, 사고커플 섀기(매튜 리라드)와 스쿠비는 자신들 역시 명탐정이라는 사실을 입증하기 위해 단 둘이서 사건 해결을 위한 단서를 찾아 나서고, 가장 유력한 용의자로 옛날 미스터리 주식회사에 의해 교도소에 보내진 흑기사 몬스터 위클스 영감(피터 보일)을 지목한다. 과연 그가 미스터리 주식회사에 복수하기 위하여 괴물들을 만들어 쿨스빌을 습격한 것일까? 엎친 데 덮친 격, 미스터리 주식회사의 아이디어 뱅크 벨마(린다 카델리니)는 또 다른 용의자이자 쿨스빌 범죄박물관 총책임자인 패트릭 와이즐리(세스 그린)에게 빠져들고, 꽃미남 리더 프레드(프레디 프린즈 주니어)와 얼짱 다프네(새라 미셸 겔러)는 몬스터들을 이용해 쿨스빌을 파괴하려는 음모를 가진 마스크맨의 정체를 밝히는 데 총력을 다한다.
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유령을 쫓거나 불가사의한 사건을 해결해온 '미스터리 주식회사'의 맴버들은 성격차이로 서로 뿔뿔이 흩어진 지 2년 후, 다시 '미스테리 주식회사'를 재결성해서 '스푸키' 섬에서 발생한 또다른 사건을 맡게 된다. 그 섬에서 초자연적인 괴현상이 계속 발생하자, 손님이 끊길 것을 염려한 섬 주인인 몬다베리우스(로완 아킨슨 분)가 사건 수사를 의뢰하기 위해 '미스터리 주식회사'의 맴버를 초대한 것이다. '미스터리 주식회사'의 멤버는 스쿠비-두라는 말하는 견공과 프레드(프레디 프린즈 Jr. 분), 다프네(사라 미셸 겔러 분), 섀기(매튜 릴라드 분), 벨마 (린다 카델리니 분)로 구성되어 있다. 본의 아니게 다시 한자리에 모인 멤버들은 서로의 성격차이와, 과거의 갈등을 묻어둔 채 다시 한마음으로 사건해결에 임하는데... 과연 이들은 알 수 없는 존재의 위협으로부터 자신들과, 나아가서 인류까지 구해낼 수 있을 것인가?
