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Os irmãos Mario e Luigi, de ascendência italiana, vivem em Brooklyn (Nova Iorque), onde trabalham como canalizadores. Certo dia, durante um serviço de reparação de uma conduta de água, são sugados por um tubo e transportados para o Reino Cogumelo, um universo paralelo governado pela Princesa Peach. Sem saber do paradeiro do irmão, Mario vai ter de aprender a sobreviver naquele lugar, adquirindo capacidades bizarras mas que serão grandes mais-valias para destruir os planos de Bowser, um verdadeiro vilão que tenciona dominar o mundo.
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O ex-ator mirim e astro de TV, Balthazar Bratt, foi um típico malvado bem-sucedido nos anos 80 e agora está de volta à ativa. Ele vai aterrorizar a vida de Gru, Agnes, Margo, Edith, Dr. Nefario e os atrapalhados Minions. Em meio a tudo isso, Gru também vai encontrar o seu irmão gêmeo, Drew.
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Num apartamento de Manhattan vive o cão Max, um pequeno terrier que sente a sua posição ameaçada com a chegada de outro cão, Duke. Mas a rivalidade inicial será suplantada pela necessidade de cooperação quando ambos se perdem nas ruas da cidade e acabam por provocar a ira de Pompom, líder de um bando de animais abandonados que planeia uma vingança contra os humanos.
